食品中大腸菌群的檢測方法！
一、何為食品中大腸菌群?
大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛(wèi)生細菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非*一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。
大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。調(diào)查研究表明，大腸菌群細菌多存在于溫血動物糞便、人類經(jīng)?；顒拥膱鏊约坝屑S便污染的地方，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多?！ 〈竽c菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。
糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內(nèi)除一般正常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在(如沙門氏菌、志賀氏菌等)，因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。 大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標之一，目前已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中。
二、食品大腸菌群檢驗方法：
由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，即：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進行。
目前國內(nèi)采用的進出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標準和原國家商檢局制訂的行業(yè)標準。兩個標準方法在檢測程序上略有不同。
(一)國家標準：國家標準采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗。
乳糖發(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。
分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)?！ ∽C實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。
報告：根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml(g)大腸菌群的MPN值。
具體操作參見GB4789.3-94 《中華人民共和國國家標準食品衛(wèi)生微生物學檢驗 大腸菌群測定》
(二)原國家商檢局制訂的行業(yè)標準，等效采用美國FDA的標準方法，用于對出口食品中的大腸桿菌進行檢測。本方法采用兩步法：
推測試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。
證實試驗：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性。查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。
具體操作參見 SN0169-92 《中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標準 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》
三、說明：
1.MPN檢索表：
MPN 為大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡稱。這種方法，對樣品進行連續(xù)系列進行稀釋，加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)近似的數(shù)值。
MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。注意國家標準和行業(yè)標準中所附MPN表所用稀釋度是不同的，而且結(jié)果報告單位也不相同。
2.初發(fā)酵和證實試驗：
無論是國家標準的三步法還是行業(yè)標準的兩步法，都利用了乳糖發(fā)酵管進行了兩次發(fā)酵試驗，培養(yǎng)基的配制略有不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”?！ 〕醢l(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經(jīng)過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。
3.產(chǎn)氣量與倒管：
在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡(有時比小米粒還小)，有時可以遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進一步試驗。
4.挑選菌落：
國家標準中，需要對初發(fā)酵陽性培養(yǎng)物接種伊紅美藍平板分離，對典型和可疑菌落進行觀察和證實試驗。由于大腸菌群是一群細菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復(fù)雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。國家標準方法規(guī)定伊紅美藍平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤時，檢出率高;紅色、粉紅色菌落檢出率較低。
另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個菌落，由于機率問題，尤其當菌落不典型時，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應(yīng)多挑幾個，以免出現(xiàn)假陰性。5.抑菌劑：
大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。
國家標準中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑，行業(yè)標準中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。
抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細菌的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時也產(chǎn)生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱量時稍有誤差，即可對抑菌作用產(chǎn)生影響，因此抑菌劑的添加應(yīng)嚴格按照標準方法進行。
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