免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)，它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。
凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA 結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)zui初用于研究DNA 結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。
| Western blot 檢測(cè) | 1200元/膜 | 每張膜1--8樣本，一抗另計(jì) |
| EMSA | 2800元/膜 | 每張膜1--8樣本，包括探針及試劑 |
上海信帆代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目:ELISA,免疫組化,免疫印跡Western Blot,放射免疫,實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ,特殊染色,病理學(xué)檢測(cè)技術(shù)服務(wù)等等!我們擁有的實(shí)驗(yàn)室,客戶檢測(cè)項(xiàng)目均提供實(shí)驗(yàn)室儀器型號(hào),提供操作詳細(xì)步驟.歡迎!
Western Blot實(shí)驗(yàn)
成功完成Western Blot檢測(cè)，必須滿足4個(gè)條件：
凝膠洗脫：轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中，將無法在膜上進(jìn)行分析
吸附到膜上：在轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進(jìn)行分析
處理期間仍截留在膜上：在轉(zhuǎn)移后的處理過程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上
處理過程中可接近：被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測(cè)試劑接觸，如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無法檢測(cè)
成功進(jìn)行WB檢測(cè)，則設(shè)置合適正確的對(duì)照是*的，只要正確設(shè)置了這些對(duì)照，即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問題所在，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性！一般需要設(shè)置的對(duì)照如下：
陽(yáng)性對(duì)照：明確表達(dá)檢測(cè)蛋白的組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的工作效率
陰性對(duì)照：明確不表達(dá)檢測(cè)蛋白組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的特異性
二抗對(duì)照：不加一抗，用于檢測(cè)二抗的特異性
內(nèi)參對(duì)照：檢測(cè)標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)
空白對(duì)照：不加一抗和二抗；用于檢測(cè)膜的性質(zhì)和封閉的效果
WB 檢測(cè)基本過程
1 、獲取細(xì)胞或組織裂解物
1)根據(jù)檢測(cè)蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：
| 蛋白位置 | 推薦buffer |
| 全細(xì)胞 | NP-40 or RIPA |
| 胞漿（可溶性蛋白） | Tris-HCl |
| 胞漿（骨架結(jié)合蛋白） | Tris-Triton |
| 膜蛋白 | NP-40 or RIPA |
| 核蛋白 | RIPA or 核蛋白提取試劑盒 |
| 線粒體蛋白 | RIPA or 線粒體分離試劑盒 |
亦可購(gòu)買商業(yè)化的蛋白提取試劑盒來保證標(biāo)本制備的質(zhì)量
2)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性！
2 、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據(jù)情況將標(biāo)本保存在-20°C /-80°C備用，進(jìn)行免疫沉淀（IP）或者直接進(jìn)行電泳分離蛋白
3 、電泳分離蛋白質(zhì)
根據(jù)待測(cè)蛋白狀態(tài)確定電泳條件：
| 待測(cè)蛋白狀態(tài) | 凝膠條件 | 上樣buffer | 電泳buffer |
| Reduced - Denatured | 還原，變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Reduced - Native | 還原，不變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
| Oxidized - Denatured | 不還原，變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Oxidized - Native | 不還原，不變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
根據(jù)待測(cè)蛋白分子量大小確定凝膠濃度
| 蛋白分子量（kDa） | 凝膠濃度（％） |
| 4-40 | 20 |
| 12-45 | 15 |
| 10-70 | 12.5 |
| 15-100 | 10 |
| 25-200 | 8 |
4 、轉(zhuǎn)膜
根據(jù)不同的檢測(cè)目的和待測(cè)蛋白的特性,選擇合適的膜類型。常用的轉(zhuǎn)移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術(shù)參數(shù)及比較如下：
| | PVDF膜 | NC膜 | 尼龍膜 |
| 靈敏度和分辨率 | 高 | 高 | 高 |
| 背景 | 低 | 低 | 較高 |
| 蛋白結(jié)合能力 | 100-200ug/cm2（適用于SDS存在時(shí)與蛋白結(jié)合） | 80-100ug/cm2 | >400ug/cm2 |
| 機(jī)械強(qiáng)度 | 強(qiáng) | 干的膜易脆 | 軟而結(jié)實(shí) |
| 溶劑抗性 | 強(qiáng) | 差 | 差 |
| 使用前是否需要浸潤(rùn) | 甲醛潤(rùn)濕 | 緩沖液潤(rùn)濕 | 緩沖液潤(rùn)濕 |
| 適用染色方法 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁 | 不能用陰離子染料 |
| 適用檢測(cè)方法 | 顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性、化學(xué)熒光、快速免疫檢測(cè) | 顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性 | 顯色、化學(xué)發(fā)光、放射性 |
| 適用范圍 | 普通蛋白WB、糖蛋白檢測(cè)、蛋白質(zhì)測(cè)序、氨基酸分析、重復(fù)檢測(cè) | 普通蛋白WB、氨基酸分析、重復(fù)檢測(cè)。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白 | 低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測(cè)常用 |
| 價(jià)格 | 高 | 較低 | 低 |
5 、封閉
去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
6 、一抗孵育
一抗的選擇成功與否，是整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵：選擇一抗有以下幾個(gè)注意點(diǎn)：
選擇適合檢測(cè)標(biāo)本種屬的一抗（說明書有驗(yàn)證）
選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗（說明書有驗(yàn)證）
選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體
一抗的保存和使用：
根據(jù)說明書的要求條件進(jìn)行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復(fù)凍融。
抗體的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，在4度保存不要超過2周
根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實(shí)驗(yàn)室條件和檢測(cè)方法等的差異，說明書推薦的稀釋比例只作參考，需要在說明書推薦的濃度周邊進(jìn)行多個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，然后選擇信噪比的抗體濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索稀釋度（1:100-1:3000）。
孵育條件：推薦4°C孵育過夜（一般大于18個(gè)小時(shí)），根據(jù)抗體親和力不同孵育時(shí)間有所區(qū)別
內(nèi)參的選擇和使用：WB 過程監(jiān)測(cè)以及目的蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)！
WB常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù)：
| 內(nèi)參名稱 | 分子量大小 | 適用范圍 |
| beta-actin | 43kDa | 胞漿和全細(xì)胞 |
| GAPDH | 30-40kDa | 胞漿和全細(xì)胞 |
| Tubulin | 55kDa | 胞漿和全細(xì)胞 |
| VCDA1/Porin | 31kDa | 線粒體 |
| COXIV | 16kDa | 線粒體 |
| TBP | 38kDa | 細(xì)胞核 |
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7 、二抗孵育
根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時(shí)
8 、底物孵育
選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光，靈敏度高且背景低，節(jié)省抗體用量
9 、結(jié)果分析和檢測(cè)
凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)或者暗室曝光到膠片
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